|
|
Functional analysis of the TSSC4 chaperone during snRNP formation
Vojáčková, Jitka ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Vaňková Hausnerová, Viola (oponent)
Sestřih je proces, během kterého jsou nekódující sekvence (introny) vystřiženy z pre-mRNA a exony spojeny. Celý tento proces je katalyzován multi-megadaltonovým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (zkráceně snRNP částice), jenž každá obsahuje svoji vlastní malou jadernou RNA a sadu proteinů specifických pro každou částici. Během biogeneze snRNP částic jsou U4 a U6 snRNP částice spojeny za vzniku di-snRNP částice, která je dále asociována s U5 snRNP částicí a tím dává vzniku tri-snRNP. S pomocí hmotnostní spektrometrie jsme nalezly dříve necharakterizovaný protein interagující s U5 snRNP částicí, zvaný TSSC4. S použitím imunoprecipitace jsem potvrdila specificitu TSSC4 pro U5 snRNP a nalezla oblast TSSC4 zodpovědnou za interakci s U5 snRNP. Nezávisle na U5 snRNP částici, TSSC4 interaguje s PRPF19, komponentem komplexu, který se účastní katalytické aktivace sestřihového komplexu. Snížení koncentrace TSSC4 v HeLa buňkách způsobuje akumulaci di-snRNP specifických RNA a U5 snRNP částice v Cajalových tělískách, jaderných organelách důležitých pro biogenezi snRNP částic. Podobný fenotyp byl dříve pozorován po zastavení tvorby tri-snRNP částice. Abych otestovala důležitost TSSC4 pro vznik tri-snRNP, pomocí gradientové ultracentrifugace jsem rozdělila...
|
|
|
Úloha cyklofilinů v sestřihu
Cit, Zdeněk ; Půta, František (vedoucí práce) ; Novotný, Ivan (oponent)
Sestřih je proces nezbytný pro správné fungování eukaryotických buněk. Jedná se o velice složitý a dynamický děj, na němž se podílí velké množství proteinů, které plní různorodé funkce buď přímo uvnitř sestřihového komplexu, nebo i mimo něj. Mezi proteiny, které v sestřihu plní důležitou úlohu, patří nepochybně i cyklofiliny. Ty pravděpodobně způsobují konformační změny ostatních komponentů sestřihového komplexu, nebo je udržují v požadovaných konformacích, čímž přispívají k dynamice spliceosomu. Tato práce poskytuje přehled cyklofilinů, u nichž byl potvrzen podíl na sestřihu pre-mRNA, a shrnuje návrhy možných funkcí, jež tyto proteiny mohou v sestřihu zastávat.
|
|
|
Fyzické interakce sestřihového faktoru Prp45
Kratochvílová, Eliška ; Folk, Petr (vedoucí práce) ; Doubravská, Lenka (oponent)
Je známo, že posttranslační stav chromatinu, transkripce a sestřih se vzájemně ovlivňují, přesto ve studiu jejich vztahů zbývá ještě mnoho nezodpovězených otázek. V kvasince Saccharomyces cerevisiae lze relativně snadno navodit stavy, kdy je v životaschopných buňkách sestřih oddělen od transkripce. Takového stavu bylo docíleno mutací sestřihového faktoru Prp45, jehož savčí homolog se prokazatelně účastní jak regulace transkripce, tak sestřihových reakcí. Na základě předem indikovaných interakcí v dvouhybridním systému byla v této práci hledána fyzická spojení proteinu Prp45 s proteiny účastnícími se posttranslačních modifikací chromatinu. Jejich nalezení by poskytlo vhled do vzájemných vztahů procesů genové exprese. Koimunoprecipitací ani afinitní purifikací nebyly nalezeny fyzické interakce mezi proteinem Prp45 a námi zvolenými regulátory chromatinu. O alternativních přístupech uvažujeme. Koprecipitačními metodami byla dále blíže lokalizována interakce proteinu Prp46 se zkrácenými variantami proteinu Prp45. Toto pozorování rozšířilo naše znalosti o protein- proteinových interakcích v rámci sestřihového komplexu.
|
|
|
Recyklace sestřihových komplexů
Klimešová, Klára ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Hálová, Martina (oponent)
Ve většině lidských genů jsou kódující úseky (exony) přerušovány dlouhými nekódujícími sekvencemi (introny). Po přepisu genu do pre-mRNA musí být tyto introny velmi přesně vyštěpeny v procesu zvaném sestřih. Sestřih je zajišťován velmi složitým a dynamickým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (snRNP) a řady sestřihových proteinů. Každá částice obsahuje jednu malou jadernou RNA a několik specifických proteinů a vzniká postupným procesem, který se odehrává v jádře i cytoplazmě. Závěrečné úpravy pak probíhají v jaderných Cajalových tělíscích. Hotové částice nasedají v přesně daném pořadí na pre-mRNA a formují komplex, který katalyzuje dvě transesterifikační reakce potřebné k vystřižení intronu a spojení okolních exonů a následně se opět rozpadá na jednotlivé snRNP. Ribonukleoproteinové částice během sestřihu podstupují nejrůznější změny jak v konformaci, tak v proteinovém složení. Proto musí před každým dalším kolem sestřihu projít recyklačními úpravami a vrátit se do stavu vhodného pro připojení k novému sestřihovému komplexu. Recyklační fázi sestřihového cyklu nicméně zatím obklopuje více otázek než odpovědí. Cílem této práce je pokusit se ve světle nových poznatků alespoň na některé z nich odpovědět.
|
|
|
Structural characterisation of Prp45 and its interaction partners
Kulhánková, Lucie ; Novotný, Marian (vedoucí práce) ; Kostovčíková, Klára (oponent)
Prp45 je SNW protein, který je součástí spliceozomu, a tedy se účastní sestřihu pre-mRNA na mRNA. Ve spliceozomu se Prp45 přidává před sestřihovými reakcemi jako součást NTC komplexu. Prp45 má několik známých interakčních partnerů (například U2AF, Cyp2, Prp5, Prp22, Clf1 a Cwc3). Tyto proteiny mají ve spliceozomu mnoho funkcí od jeho stabilizování po regulaci sestřihových reakcí. Spliceozom se skládá z několika desítek proteinů a několika RNA a při vykonávání své funkce prochází masivními strukturními proměnami. O struktuře spliceozomu bylo až do nedávna známo velice málo, nicméně nedávné studie nám poskytují pohled do interakční sítě toho komplexu. V této práce jsme se soustředili na identifikaci jak dříve navržených tak nových interakčních partnerů Prp45. S využitím dostupných spliceozomálních struktur jsme se pokusily tyto proteiny popsat strukturně a funkčně. Klíčová slova: sestřih, Prp45, 3D struktura, spliceozom, vazební partneři
|
|
|
Structural characterisation of Prp45 and its interaction partners
Kulhánková, Lucie ; Novotný, Marian (vedoucí práce) ; Kostovčíková, Klára (oponent)
Prp45 je SNW protein, který je součástí spliceozomu, a tedy se účastní sestřihu pre-mRNA na mRNA. Ve spliceozomu se Prp45 přidává před sestřihovými reakcemi jako součást NTC komplexu. Prp45 má několik známých interakčních partnerů (například U2AF, Cyp2, Prp5, Prp22, Clf1 a Cwc3). Tyto proteiny mají ve spliceozomu mnoho funkcí od jeho stabilizování po regulaci sestřihových reakcí. Spliceozom se skládá z několika desítek proteinů a několika RNA a při vykonávání své funkce prochází masivními strukturními proměnami. O struktuře spliceozomu bylo až do nedávna známo velice málo, nicméně nedávné studie nám poskytují pohled do interakční sítě toho komplexu. V této práce jsme se soustředili na identifikaci jak dříve navržených tak nových interakčních partnerů Prp45. S využitím dostupných spliceozomálních struktur jsme se pokusily tyto proteiny popsat strukturně a funkčně. Klíčová slova: sestřih, Prp45, 3D struktura, spliceozom, vazební partneři
|
|
|
Functional analysis of the TSSC4 chaperone during snRNP formation
Vojáčková, Jitka ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Vaňková Hausnerová, Viola (oponent)
Sestřih je proces, během kterého jsou nekódující sekvence (introny) vystřiženy z pre-mRNA a exony spojeny. Celý tento proces je katalyzován multi-megadaltonovým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (zkráceně snRNP částice), jenž každá obsahuje svoji vlastní malou jadernou RNA a sadu proteinů specifických pro každou částici. Během biogeneze snRNP částic jsou U4 a U6 snRNP částice spojeny za vzniku di-snRNP částice, která je dále asociována s U5 snRNP částicí a tím dává vzniku tri-snRNP. S pomocí hmotnostní spektrometrie jsme nalezly dříve necharakterizovaný protein interagující s U5 snRNP částicí, zvaný TSSC4. S použitím imunoprecipitace jsem potvrdila specificitu TSSC4 pro U5 snRNP a nalezla oblast TSSC4 zodpovědnou za interakci s U5 snRNP. Nezávisle na U5 snRNP částici, TSSC4 interaguje s PRPF19, komponentem komplexu, který se účastní katalytické aktivace sestřihového komplexu. Snížení koncentrace TSSC4 v HeLa buňkách způsobuje akumulaci di-snRNP specifických RNA a U5 snRNP částice v Cajalových tělískách, jaderných organelách důležitých pro biogenezi snRNP částic. Podobný fenotyp byl dříve pozorován po zastavení tvorby tri-snRNP částice. Abych otestovala důležitost TSSC4 pro vznik tri-snRNP, pomocí gradientové ultracentrifugace jsem rozdělila...
|
|
|
Je sestřih pre-mRNA v kvasince S. cerevisiae procesem ko- nebo posttranskripčním?
Cihlářová, Zuzana ; Půta, František (vedoucí práce) ; Kozáková, Eva (oponent)
Donedávna se pohlíželo na sestřih a transkripci jako na téměř nezávislé procesy. Dnes však řada studií přináší mnoho důkazů o jejich propojení, a to i u kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Propojení těchto procesů je zprostředkováno zejména C-terminální doménou RNA polymerázy II, kterou tvoří tandemově se opakující heptapeptidové sekvence - YSPTSPS. Aminokyselinové zbytky heptapeptidové sekvence jsou v průběhu transkripce specificky fosforylovány, což reguluje samotný průběh transkripce a vazbu faktorů, mj. nezbytných pro úpravu vznikajícího transkriptu. Úpravy primárního transkriptu tak probíhají u vyšších eukaryot zejména kotranskripčně, tzn. před ukončením transkripce a uvolněním funkční mRNA. Názor na problematiku kotranskripčního sestřihu se u S. cerevisiae v posledních letech značně měnil. Nicméně dnes se pohlíží na sestřih pre-mRNA většiny genů S. cerevisiae jako na kotranskripční proces. RNA polymeráza II zpomaluje v oblasti terminálního exonu, což poskytuje jednotlivým komponentám spliceosomu dostatek času pro jejich sestavení na pre-mRNA a pro katalýzu sestřihu ještě před dokončením transkripce. Klíčová slova: kotranskripční sestřih, RNA polymeráza II, Saccharomyces cerevisiae, U snRNP, spliceosom, pre-mRNA
|
|
|
Formation of splicing machinery in the context of the cell nucleus
Stejskalová, Eva ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Vanáčová, Štěpánka (oponent) ; Malínský, Jan (oponent)
Většina genů kódujících proteiny vyšších eukaryot obsahuje introny, které musí být odstraněny z primárních transkriptů. Vznikající mRNA může být poté použita jako templát pro syntézu proteinů. Sestřih intronů probíhá za pomoci složitého sestřihového komplexu, který se skládá z malých jaderných ribonukleoproteinových částic. Tyto částice vznikají během několika postupných kroků, které se odehrávají jak v jádře, tak v cytoplazmě. Sestřihový komplex se poté postupně skládá na molekule pre- mRNA. Jedná se o velmi dynamický a přesně regulovaný proces, který závisí nejen na sekvenci samotné pre-mRNA, ale záleží i na stavu celého jádra, např. na modifikacích chromatinu. Mezi základní nezodpovězené biologické otázky patří například: Jak buňky řídí, kdy a kde se sestřihový komplex poskládá? Co předurčuje, které introny budou vystřiženy? V této práci zkoumáme sestřihový komplex a jeho skládání v kontextu buněčného jádra z několika různých úhlů pohledu. Za prvé se věnujeme neočekávané souvislosti mezi sestřihovým faktorem U1-70K a komplexem SMN (z angl. survival of motor neurons), který je hlavním účastníkem biosyntetické dráhy malých jaderných ribonukleoproteinových částic. Podařilo se nám odhalit, že protein U1-70K interaguje s komplexem SMN a že tato interakce je klíčová pro stabilitu gems, malých nemembránových...
|
|
|
Recyklace sestřihových komplexů
Klimešová, Klára ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Hálová, Martina (oponent)
Ve většině lidských genů jsou kódující úseky (exony) přerušovány dlouhými nekódujícími sekvencemi (introny). Po přepisu genu do pre-mRNA musí být tyto introny velmi přesně vyštěpeny v procesu zvaném sestřih. Sestřih je zajišťován velmi složitým a dynamickým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (snRNP) a řady sestřihových proteinů. Každá částice obsahuje jednu malou jadernou RNA a několik specifických proteinů a vzniká postupným procesem, který se odehrává v jádře i cytoplazmě. Závěrečné úpravy pak probíhají v jaderných Cajalových tělíscích. Hotové částice nasedají v přesně daném pořadí na pre-mRNA a formují komplex, který katalyzuje dvě transesterifikační reakce potřebné k vystřižení intronu a spojení okolních exonů a následně se opět rozpadá na jednotlivé snRNP. Ribonukleoproteinové částice během sestřihu podstupují nejrůznější změny jak v konformaci, tak v proteinovém složení. Proto musí před každým dalším kolem sestřihu projít recyklačními úpravami a vrátit se do stavu vhodného pro připojení k novému sestřihovému komplexu. Recyklační fázi sestřihového cyklu nicméně zatím obklopuje více otázek než odpovědí. Cílem této práce je pokusit se ve světle nových poznatků alespoň na některé z nich odpovědět.
|
host ::
RSS.